.RU

Особенности адипокинового профиля и метаболизма коллагена при различных вариантах течения беременности 03. 01. 04 биохимия




На правах рукописи

Шульга Александр Сергеевич

ОСОБЕННОСТИ АДИПОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ И МЕТАБОЛИЗМА КОЛЛАГЕНА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ТЕЧЕНИЯ

БЕРЕМЕННОСТИ


03.01.04 – биохимия


Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук


Краснодар – 2012


Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России).


^ Научный руководитель – доктор медицинских наук

Шестопалов Александр Вячеславович

Официальные оппоненты:

Нагиев Эйзудин Рамазанович, доктор медицинских наук, профессор,

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дагестанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО ДГМА Минздравсоцразвития России), заведующий кафедрой медицинской и клинической биохимии.


Корочанская Светлана Петровна,кандидат медицинских наук,доцент,

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России), доцент кафедры фундаментальной и клинической биохимиии.


^ Ведущая организация – Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии имени Д.О.Отта" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук(ФГБУ "НИИАГ им. Д.О. Отта" СЗО РАМН).


Защита диссертации состоится 23 апреля 2012 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.038.02 на базе ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861)262-73-75).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России.


Автореферат разослан «______» ____________2012 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета, Скорикова

профессор Людмила Анатольевна


^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На сегодняшний день демографические проблемы в РФ приобретают важное геостратегическое и социально-экономическое значение. Решение их невозможно без снижения уровней материнской и перинатальной заболеваемости и смертности [О.В.Ремнева, 2011]. Поиск резервов снижения данных показателей ограничивается недостаточностью знаний этиопатогенетических основ акушерско-гинекологической патологии. Молекулярные механизмы, регулирующие системные метаболические изменения в обмене веществ при физиологической и осложненной беременности, еще до конца не изучены. Однако известно, что каждый из уровней репродуктивной оси – гипоталамус, гипофиз и гонады способны отвечать на изменения в метаболизме и энергетическом статусе организма. Установлено, что для наступления овуляции необходим определенный критический уровень массы жировой ткани [P.A.Rouen et al., 2010; M.Pereira et al., 2011]. С другой стороны, ожирение и диабет негативно влияют на фертильность [R. Pasquali et al., 2006; G.Lambert-Messerlian et al., 2011].

Одними из ключевых регуляторов метаболизма являются такие эндокринные факторы, как адипокины (лептин, адипонектин, резистин), инсулин и компоненты оси грелина (грелин – гормон роста – инсулиноподобные факторы роста) [J.W.Hill et al., 2008].

На сегодняшний день неоспорима роль адипокинов в становлении и поддержании физиологического функционирования репродуктивной системы человека [C.Tersigni et al., 2011]. Грелин, известный как «гормон голода», стимулирует в противоположность лептину потребление питательных веществ и способствует таким образом повышению энергетического статуса организма. Известен значительный вклад гормональной оси грелина в регуляцию процессов развития плаценты, апоптоза, ангиогенеза и воспаления [M.C.García et al., 2007].

Установлено, что эндокринная активность жировой ткани при беременности возрастает, что выражается в изменении концентраций адипокинов в материнской крови [А.В. Шестопаловс соавт., 2011]. Нельзя упускать из внимания и тот факт, что дифференцировка адипоцитов, фибробластов и остеобластов происхолит из единой клетки-предшественницы – мезенхимальной стволовой клетки [P.Bianco et al., 2008]. Поэтому, возможно, что при беременности также изменяется функциональная активность клеток, продуцирующих коллаген. К тому же, резорбция и репаративный синтез костной ткани материнского организма с целью обеспечения плода кальцием, размягчение связочного аппарата таза и стромы родовых путей, созревание шейки матки при беременности сопровождаются существенными изменениями в метаболизме соединительной ткани [В.И.Кулаковс соавт., 2008; О.Р. Баев, 2010].

Таким образом, целью исследования явилась оценка эндокринной активности жировой ткани, гормональной оси грелин – гормон роста и метаболизма коллагена I типа при различных вариантах течения беременности для отбора диагностических критериев осложнений беременности.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи исследования:

  1. Исследовать уровни глюкозы, инсулина и индекса инсулинорезистентности в материнской и пуповинной крови при различных вариантах течения беременности.

  2. Оценить уровни лептина, резистина и адипонектина в материнской и пуповинной крови при различных вариантах течения беременности.

  3. Изучить содержание грелина, гормона роста (ГР), инсулиноподобного фактора роста I типа (ИПФР-1) в материнской и пуповинной крови при различных вариантах течения беременности.

  4. Проанализировать особенности метаболизма коллагена I типа (CICP, Crosslaps) в материнской крови при различных вариантах течения беременности.

  5. Провести оценку роли изучаемых гормональных факторов в патогенезе гестоза, истинной угрозы прерывания беременности, макросомии плода, установить диагностическую значимость исследуемых параметров и взаимосвязи между ними.

^ Научная новизна. Впервые определен адипокиновый профиль (лептин, адипонектин, резистин), произведена оценка функциональной активности оси грелина и особенностей метаболизма соединительной ткани при таких акушерских состояниях как истинная угроза прерывания беременности и феномен макросомии плода.

Показана взаимосвязь продукции резистина, адипонектина и лептина с развитием физиологической инсулинорезистентности в III триместре.

Впервые установлено, что истинная угроза прерывания беременности сопровождается развитием патологического инсулинорезистентного состояния, характерной чертой которого является снижение уровня резистина и нарастание концентрации лептина.

Впервые при макросомии плода установлена ассоциация повышенных уровней гормона роста в материнском организме с отношением лептин/резистин. Также при формировании крупных размеров плода выявлено повышение концентрации лептина как в материнской, так и в пуповинной крови.

Установлено наличие ассоциации между содержанием гормона роста и адипонектина при гестозе, макросомии плода и истинной угрозе прерывания, которая не характерна для физиологической беременности.

^ Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе исследования данные расширяют представления о роли жировой ткани и гормональной оси грелина в поддержании физиологической беременности.

Расширены представления о роли и механизмах формирования инсулинорезистентности при физиологической и осложненной беременности.

Установлена роль жировой ткани в развитии макросомии плода, истинной угрозы прерывания беременности, гестоза.

Изучена связь эндокринной функции жировой ткани с активностью системы грелина и метаболизмом соединительной ткани при различных вариантах течения беременности, что позволило получить более полное представление о регуляторных системах организма женщины при физиологической и осложненной беременности.

Установленные при помощи математических и статистических методов информативные диагностические критерии гестоза, истинной угрозы прерывания беременности и макросомии плода позволяют совершенствовать раннюю диагностику осложнений и оптимизировать процесс ведения беременности и родоразрешения.

Материалы исследования используются в курсе лекций на кафедре общей и клинической биохимии №2 РостГМУ, а также в практике клинико-диагностической лаборатории ЗАО «Наука», г. Ростов-на-Дону.

Разработан новый способ диагностики гестоза тяжелой степени. Регистрационный номер заявки на патент: 2011135546 от 25.08.2011.

Работа выполнена в рамках гранта Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» по теме «Разработка технологии мониторинга репродуктивной функции человека и развития плода с использованием новых геномных и постгеномных маркеров», государственный контракт № 02.740.11.0501 от 18.11.2009 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. В динамике физиологической беременности и при ее осложненном течении – истинной угрозе прерывания беременности и макросомии плода в организме матери и плода модулируется чувствительность тканей к инсулину, в частности, через изменение адипокинового профиля.

  2. Изменения активности оси грелина и метаболизма коллагена I типа способствуют физиологическому течению беременности и участвуют в патогенетических механизмах осложненных вариантов – истинной угрозы прерывания беременности, гестоза и макросомии плода.

  3. Отобранные при помощи ROC-анализа показатели содержания адипокинов, компонентов оси грелина и метаболитов коллагена I типа в силу высокой значимости, чувствительности и специфичности могут использоваться в качестве диагностических критериев диагностики гестоза, истинной угрозы прерывания беременности и макросомии плода.

^ Апробация работы. Результаты работы представлены на Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (г. Санкт-Петербург, 23-26 ноября 2010 г.); на XLIX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, 16-20 апреля 2011 г.); на 65-й итоговой научной конференции молодых ученых РостГМУ с международным участием (г. Ростов-на-Дону, 22 апреля 2011 г.); на I Международном Конгрессе по перинатальной медицине

(г. Москва, 16–18 июня 2011 г.); на V Региональном научном форуме "Мать и дитя" (г. Геленджик, 28–30 июня 2011 г.), на XV научно-практическом форуме «Национальные дни лабораторной медицины России – 2011» (г. Москва, 4-6 октября 2011 г.).

^ Публикация результатов исследования. По теме диссертационного исследования опубликовано 12 работ, в том числе 7 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых журналов, рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени.

^ Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 177 страницах и содержит – общую характеристику работы, главы – обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, заключение, выводы, список литературы, включающий 18 отечественных и268зарубежных источников. Работа содержит 32 таблицы, иллюстрирована 35 рисунками.


^ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

С целью реализации поставленных задач в ходе выполнения исследовательской работы было обследовано 188 беременных женщин и родильниц на разных сроках физиологической и осложненной беременности на базах кафедры акушерства и гинекологии №1 ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития РФ.

^ Критерии формирования и количественные характеристики групп:

I группа – физиологическая беременность сроком 16 – 26 недель (n=52).

II группа – беременность сроком 16 – 26 недель, осложненная истинной угрозой прерывания беременности (n=18).

III группа – физиологическая беременность сроком 38 – 40 недель (n=64).

IV группа – беременность сроком 38 – 40 недель с наличием клинических, допплерометрических, ультразвуковых и кардиотокографических признаков тяжелого гестоза (n=14).

V группа – беременность сроком 38 – 40 недель с макросомией плода (n=10).

VI группа – небеременные женщины (лютеиновая фаза цикла), (n=30).

В момент родоразрешения у пациенток III, IV и V групп производился забор пуповинной крови (всего – 88 образцов). Исследуемые группы были сопоставимы по возрастным характеристикам.

Уровни исследуемых показателей определяли методом иммуноферментного анализа (ELISA) с применением тест-систем следующих производителей: инсулин, ГР – «DRG» (США); лептин – «DBC» (Канада); адипонектин, резистин – «BioVendor» (Чехия); грелин – «Phoenix Pharmaceuticals» (США); ИПФР-1 – «DSL» (США), пропептид проколлагена I типа (CICP) и телопептид коллагена I типа (Crosslaps)– «Quidel corp.» (Германия). Концентрацию глюкозы исследовали в сыворотке венозной крови глюкозооксидазным методом. Индекс инсулинорезистентности рассчитывался по формуле HOMA-IR: (инсулин, мкЕД/мл х глюкоза, ммоль/л / 22,5) [D.Matthews, 1985]. Значение больше чем 2,27 рассматривается как наличие инсулинорезистентности [R.H. Unger et. al, 2001; T.M.Wallaceet. al, 2004]. Полученные результаты обработаны с применением пакета статистических программ. Применялись показатели вариационной статистики, такие как среднее значение, стандартная ошибка среднего, коэффициент корреляции. Характер распределения данных оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для определения достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента.Для оценки диагностической значимости исследуемых критериев определяли чувствительность и специфичность, выполняли построение характеристической кривой (ROC-анализ).


^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В динамике физиологической беременности во втором триместре нами отмечено увеличение чувствительности тканей к инсулину, сменяющееся затем нарастанием инсулинорезистентности в третьем триместре (таблица 1). Индекс инсулинорезистентности (HOMA-IR) снижаясь в сравнении с показателями небеременных во втором триместре на 23,93% (р= 0,005), в третьем триместре увеличивался на 29,33% (р= 0,01). Таким образом, первая половина беременности может быть охарактеризована как анаболическая фаза с относительным повышением чувствительности к инсулину и как следствие – активацией липогенеза и увеличением общей массы жировой ткани, что сопровождается депонированием питательных веществ. Поздний гестационный срок, напротив, определяется как катаболическая фаза беременности со снижением чувствительности к инсулину [K.Y.Lain, P.M.Catalano, 2007]. Нарастание инсулинорезистентности приводит к увеличению содержания в крови глюкозы и свободных жирных кислот, активно утилизирующихся фетоплацентарным комплексом. В третьем триместре замедляются темпы роста плода, но увеличиваются темпы прибавки в массе, которая составляет к моменту родов, как правило, более 3000г. Для достижения такого веса требуется интенсивное снабжение плода питательными веществами, в том числе, путем мобилизации депонированных прежде в материнском организме в первую половину беременности.

Анализ данных динамики уровней адипокинов при физиологической беременности показал снижение(р< 0,001) концентрации адипонектина в 2,5 раза, и нарастание уровней лептина и резистина – в 2,1 и 2,6 раз соответственно, в сравнении с показателями небеременных (р< 0,001) (таблица 1).

Таблица 1

Соматометрия, уровни адипокинов и инсулина в материнской крови в динамике физиологической беременности


Группы


Показатель

Небеременные

(VI группа,

n=30)

Физиологическая беременность

16 – 26 недель

(I группа,n=52)

38 – 40 недель

(III группа, n=64)

(M±m)

(M±m)

p1

(M±m)

p2

p3

Масса, кг

56,6±1,24

64,75±1,44

<0,001

72,80±1,44

<0,001

<0,001

Рост, м

1,66±0,01

1,65±0,02

0,78

1,64±0,01

0,85

0,87

ИМТ, кг/м2

20,43±0,37

25,77±2,67

<0,001

27±0,47

<0,001

0,75

Инсулин, мкМЕ/мл

9,78±0,39

8,87±0,42

0,14

11,66±0,67

0,04

0,006

Глюкоза, ммоль/л

4,7±0,16

4,09±0,07

<0,001

4,22±0,19

0,12

0,53

HOMA-IR

2,09±0,13

1,59±0,09

0,005

2,25±0,26

0,72

0,01

Адипонектин, мкг/мл

15,92±2,28

13,95±1,64

0,5

6,51±0,71

<0,001

<0,001

Резистин, нг/мл

1,66±0,10

3,64±0,30

<0,001

4,33±0,39

<0,001

0,18

Лептин, нг/мл

10,54±1,67

17,27±1,67

0,008

22,17±1,8

<0,001

0,02

Адипонектин/

резистин

9,56±1,34

4,27±0,60

<0,001

1,74±0,19

<0,001

<0,001

Лептин/ инсулин

1,02±0,16

2,05±0,24

0,002

2,28±0,25

<0,001

0,34



Примечание:

р1 – статистическая значимость различий исследуемых показателей в крови небеременных женщин и беременных во втором триместре;

р2 – статистическая значимость различий исследуемых показателей в крови небеременных женщин и беременных в третьем триместре;

р3 – статистическая значимость различий исследуемых показателей в крови беременных второго и третьего триместров

Можно предполагать, что нарастание концентрации лептина при беременности обусловлено усилениемгормонпродуцирующей активности адипоцитов по мере увеличения общей массы жировой ткани, а также продукцией этого адипокина плацентой. С другой стороны, повышение уровня лептина во второй половине беременности возникает в ответ на формирование центральной резистентности к его действию, позволяющей увеличивать прием пищи, несмотря на увеличение в крови концентрации лептина – фактора насыщения [S.R.Ladyman, D.R.Grattan 2004].

Учитывая, что адипонектин повышает чувствительность тканей к инсулину и стимулирует окисление жирных кислот, а лептин снижает аппетит и наряду с резистином участвует в формировании инсулинорезистентности, можно объяснить и установленные нами изменения показателей HOMA-IR, инсулина и глюкозы в третьем триместре физиологической беременности. При этом формирование инсулинорезистентного состояния в организме матери в конце беременности сопровождалось более низкими значениями HOMA-IR, инсулина и глюкозы пуповинной крови в 2,03, 1,5 и 1,4 раз соответственно (р<0,05). Т.е. мобилизованные из депо материнского организма энергетические и пластические субстраты утилизируются в более сенситивных к инсулину фетальных тканях.

В динамике физиологической беременности также изменялась активность оси грелина (таблица 2). При этом во втором триместре регистрировались концентрации ГР, превышающие на 28,2% значения небеременных (р=0,047). В третьем триместре содержание ГР не претерпевало достоверных изменений. Вероятно, повышение концентрации данного показателя во втором триместре происходит благодаря усилению продукции ГР плацентой. Существуют доказательства того, что ГР гипофизарного происхождения во второй половине замещается на плацентарный ГР, который имеет тесную связь с процессами роста плода [M.J Freemark. 2010], стимулируя трансплацентарный перенос жирных кислот и глюкозы [H.M.Goodmanetal., 1991; L.A.Barbouretal., 2002]. Кроме того, P.Mittal с соавт. [2007] отмечают наличие плацентарного ГР в пуповинной крови, что указывает на прямые эффекты этого гормона в отношении стимуляции роста плода.

На этом фоне концентрация ИПФР-1 в сравнении с небеременными не изменялась во втором триместре, увеличиваясь в третьем триместре на 40,49% (р<0,001). Отсутствие во втором триместре на фоне возрастания уровня гормона роста параллельного увеличения концентрации его посредника – ИПФР-1, скорее всего, можно объяснить наличием периферической резистентности к действию гормона роста. Это позволяет снижать контринсулярный эффект ГР, что поддерживает повышенную сенситивность тканей к инсулину, наблюдаемую во втором триместре.

Таблица 2

Показатели оси грелина и метаболизма коллагена I типа в динамике физиологической беременности


Группы


Показатели

Небеременные

(VI группа,

n=30)

Физиологическая беременность

16 – 26 недель

(I группа, n=52)

38 – 40 недель,

(III группа, n=64)

(M±m)

(M±m)

p1

(M±m)

p2

p3

Грелин, нг/мл

0,38±0,06

0,32±0,03

0,24

0,37±0,03

0,83

0,18

Гормон роста, нг/мл

1,91±0,31

2,66±0,22

0,047

2,51±0,14

0,043

0,56

ИПФР-1, нг/мл

118,91±7,84

118,13±5,98

0,93

291,74±16,84

<0,001

<0,001

Лептин/грелин

38,4±9,74

68,72±8,06

0,03

87,72±11,12

0,004

0,16

CrossLaps, нг/мл

0,36±0,05

0,37±0,02

0,965

0,56±0,06

0,049

0,004

CICP, нг/мл

93,04±10,1

59,97±3,91

<0,001

117,45±5,36

0,027

<0,001



Примечание:

р1 – статистическая значимость различий исследуемых показателей в крови небеременных женщин и беременных во втором триместре;

р2 – статистическая значимость различий исследуемых показателей в крови небеременных женщин и беременных в третьем триместре;

р3 – статистическая значимость различий исследуемых показателей в крови беременных второго и третьего триместров.

При этом следует обратить внимание на наличие отрицательной корреляции уровня ГР в сроке 16 – 26 недель гестации с концентрацией ИПФР-1: – 0,32 (р<0,05). В третьем триместре, судя по значительному увеличению концентрации ИПФР-1, вероятно, происходит восстановление чувствительности тканей к ГР, способствующее поддержанию возросшей резистентности к инсулину в организме беременной. Высокие концентрации ИПФР-1 в материнском кровотоке, благодаря антиапоптотическому эффекту, обеспечивают поддержание функциональной активности плаценты, в которой в этот срок усиливается апоптоз [S.C.Smithetal., 1997].

Метаболизм коллагена I типа, во многом регулируемый осью грелина, согласно полученным нами результатам, претерпевал значительные изменения. В сравнении со значениями показателей в крови небеременных, во втором триместре отмечено снижение на 35,54% (р<0,001) маркера синтеза коллагена, карбокситерминального пропептида проколлагена I типа (CICP), на фоне неизменных уровней телопептида коллагена I (Crosslaps), показателя деградации коллагена. В третьем триместре выявлено усиление процессов как синтеза, так и деградации коллагена – увеличение уровней CICP и Crosslapsна 95,85% и33,93% соответственно в сравнении со значениями второго триместра (р<0,05).

Возможно снижение концентрации CICP во втором триместре связано с отсутствием стимулирующего эффекта со стороны ИПФР-1, находящегося в конъюгированной форме со связывающим протеином, концентрация которого максимальна в этот срок. Интенсификация метаболизма коллагена I типа в третьем триместре отражает адаптивные изменения в материнском организме, способствующие активному росту и значительной прибавке в массе плода. В третьем триместре усиливаются резорбция и репаративный синтез костной ткани с целью обеспечения плода кальцием, наблюдается размягчение связочного аппарата таза и стромы родовых путей, созревание шейки матки. Все эти процессы связаны с активацией метаболизма коллагена I типа. Нельзя исключать и возможность попадания в материнский кровоток метаболитов соединительной ткани плода.

При истинной угрозе прерывания беременности, морфологической основой которой является истмико-цервикальная недостаточность (МКБ 10, код 034.3), выявлено развитие патологического инсулинорезистентного состояния в организме женщин во втором триместре, что выражается нарастанием уровней инсулина на207,44% и глюкозы на 28,99% (р<0,001), а также увеличения значения индекса инсулинорезистентности на 403,14% (р<0,001) в сравнении с показателями физиологической беременности в этот срок (таблица 3).

Таблица 3

Биохимические показатели материнской крови во втором триместре беременности физиологической и при истинной угрозой прерывания




Физиологическая

беременность, M±m

Угроза прерывания беременности, M±m

Инсулин, мкМЕ/мл

8,87±0,42

27,27±3,73*

Глюкоза, ммоль/л

4,09±0,07

5,76±0,38*

HOMA-IR

1,59±0,09

8,00±1,28*

Резистин, нг/мл

3,64±0,30

2,65±0,22*

Адипонектин, мкгр/мл

13,95±1,64

14,99±1,78

Адипонектин/резистин

4,27±0,60

6,64±0,87*

Лептин, нг/мл

17,27±1,67

22,09±2,36*

Лептин/инсулин

2,05±0,24

1,04±0,20*

Грелин,нг/мл

0,32±0,03

0,23±0,02*

Гормон роста, нг/мл

2,66±0,22

0,85±0,11*

ИПФР-1, нг/мл

118,13±5,98

122,65±15,44

Лептин/грелин

68,72±8,06

118,54±15,89*

CrossLaps, нг/мл

0,37±0,02

0,27±0,03*

CICP, нг/мл

59,97±3,91

58,19±2,65


Примечание:

* – значимость различий в сравнении с физиологической беременностью (р<0,05)

Объяснением наблюдаемой нами инсулинорезистентности при истинной угрозе прерывания беременности может, отчасти, являться действие лептина, увеличение уровня которого на 21,82% определяется в этой клинической группе (р=0,04) в сравнении с физиологической беременностью. При данном осложнении в сравнении с физиологической беременностью также наблюдалось уменьшение концентрации резистина – на 27,20% (р=0,02), что можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на повышение сенситивности тканей к инсулину. Уровень адипонектина статистически значимо не изменялся.

При истинной угрозе прерывания беременности нами зарегистрировано снижение активности оси грелина. Уровни грелина и ГР в крови пациенток с истинной угрозой прерывания беременности были ниже на 28,22% (р=0,044) и212,94% (р<0,001) соответственно в сравнении со значениями физиологической беременности. Данная картина сопровождалась снижением показателя катаболизма коллагена Crosslaps на 27,03% (р=0,01). Это может быть следствием наличия определенных мутаций в системе протеолиза коллагена, что, вероятно, способствует патологической реорганизации фибрилл в волокнах и нарушению функционирования преимущественно фиброзных по своему составу органов, в частности, шейки матки с развитием ее несостоятельности при беременности.

ROC- анализ данных показал, что в диагностике истинной угрозы прерывания беременности высокоинформативны диагностические модели индекса инсулинорезистентности HOMA-IR с AUC=0,967, высокой чувствительностью – 93,33% и специфичностью – 96,15%; инсулина с AUC=0,912, чувствительностью 81,25%, специфичностью 94,55%; глюкозы с AUC=0,87, специфичностью и предсказательную ценность положительного результата в 100%, чувствительностью – 66,67%; гормона роста с AUC=0,89 и со 100% чувствительностью и предсказательной ценностью отрицательного результата, а также диагностическая модель отношения лептин/грелин с чувствительностью 84,62%, специфичностью 61,70% и AUC=0,756.

При гестозе обращает на себя внимание более высокий уровень лептина на фоне увеличения ИМТ беременной (таблица 4). В сыворотке женщин больных гестозом концентрация этого адипокина на 58,51% (р<0,001) превышала значения физиологической беременности. Помимо индукции лептином инсулинорезистентности, патогенетическое значение этого факта заключается также в активации этим адипокином симпатической нервной системы, что приводит к развитию артериальной гипертензии у беременных с гестозом [M.Aizawa-Abe, et al. 2000], и в индукции сдвига баланса цитокинов в сторону провоспалительных факторов, вследствие преобладающей активации лептином Тh-1 лимфоцитов [C.Martin-Romero et al., 2000].

Вместе с тем, участие лептина в регуляции переноса нутриентов через плаценту путем активации аминокислотной транспортной системы-А

[N.Jansson et al., 2003], стимуляции ангиогенеза [J.L. Maymóa etal., 2011], пролиферации клеток синцитиотрофобласта [D.D.Briana, A.Malamitsi-Puchner, 2009] и его антиапоптотические свойства [K.Miehle et al., 2012] позволяют рассматривать гиперлептинемию при гестозе как компенсаторный механизм, усиливающий приток питательных веществ к плоду.

Таблица 4

Биохимические изменения в материнской и пуповинной крови в IIIтриместре при беременности физиологической и при гестозе





Физиологическая

беременность, M±m

Беременность,

осложненная гестозом, M±m




^ Материнская кровь

Пуповинная кровь

Материнская кровь

Пуповинная кровь

Инсулин, мкМЕ/мл

11,66±0,67

7,70±0,31

10,92±1,12

7,67±0,48

Глюкоза, ммоль/л

4,22±0,19

2,95±0,10

3,92±0,20

3,24±0,19

HOMA-IR

2,25±0,26

1,11±0,08

1,72±0,17

1,09±0,07

Лептин, нг/мл

22,17±1,80

12,42±1,33

*37,89±4,09

*6,32±0,76

Адипонектин, мкгр/мл

6,51±0,71



7,58±1,42



Резистин, нг/мл

4,33±0,39



4,62±0,50



Лептин/ инсулин

2,28±0,25

1,67±0,22

*3,59±0,45

0,86±0,11

Адипонектин/

резистин

1,74±0,19



1,83±0,33



Грелин, нг/мл

0,37±0,03

0,26±0,02

*0,25±0,03

0,20±0,04

Гормон роста, нг/мл

2,51±0,14

9,91±0,65

2,14±0,31

*13,99±2,24

ИПФР-1, нг/мл

291,74±16,84

65,33±3,43

314,78±27,89

61,25±5,38

Лептин/грелин

92,20±11,31

54,37±9,30

*208,41±50,73

59,33±16,88

CrossLaps, нг/мл

0,56±0,06



*0,66±0,08



CICP, нг/мл

117,45±5,36



*156,51±16,26





Примечание:

* – статистически значимые изменения показателей при гестозе в сравнении с показателями физиологической беременности третьего триместра (р<0,05)

Также в материнской крови при гестозе снижались уровни грелина на 32,43% (р=0,04). Это, вероятно, связано с ингибированием лептином секреции грелина [J.Kamegaietal., 2004]. При гестозе происходит активация как синтеза, так и деградации коллагена I типа, что выражалось в повышении уровней Crosslaps и CICP – 15,15 и 24,91% соответственно (р<0,05). Возможно, что усиление метаболизма коллагена в соединительных тканях женщины на фоне рассматриваемого осложнения беременности возникает вследствие вторичной активации остеокластов циркулирующими факторами, образующимися при развитии гестоза: активными формами кислорода, ИЛ-6 и ФНО-α [G.Schett et al., 2011], приводя к резорбции костной ткани и деградации коллагена.

В пуповинной крови при гестозе отмечалось снижение уровня лептина на 49,11% (р= 0,04). Таким образом, при данном осложнении беременности на фоне возрастания уровня лептина при гестозе в материнской крови в 2 раза, значение этого адипокина в пуповинной крови, напротив, снижалось в той же степени. Снижение продукции лептина адипоцитами, вероятно, вызвано уменьшением запасов фетальной жировой ткани, о чем свидетельствует низкая масса новорожденных при гестозе. Также в пуповинной крови при этой патологии изменялся уровень гормона роста, увеличиваясь на 29,16% (р=0,02). Можно предположить, что повышение продукции и секреции гормона роста в организме плода представляет собой компенсаторную реакцию в ответ на задержку роста плода, часто выявляемую при гестозе [J.Weiler et al., 2011].

Наилучшую диагностическую значимость имеет определение в крови беременных с гестозом отношения адипонектин/резистин с AUC=0,863, чувствительностью 90% и специфичностью 81,25%, а также уровней лептина с AUC=0,783, чувствительностью 92,31% и специфичностью 54,24%.

Беременность крупным плодом характеризуется увеличением уровня инсулина в крови матерей на 14,01% (р=0,042)(таблица 5). Одновременно с этим, индекс инсулинорезистентности не имел достоверных различий между сравниваемыми группами, однако превышал пороговое значение в 2,27. Таким образом, вероятно, присутствует некоторое относительное снижение эффектов инсулина на ткани-мишени в организме матери. Как результат усиливается диффузия глюкозы через плацентарный барьер и повышаются анаболические процессы в фетальных тканях, что способствует формированию феномена макросомии плода.

Таблица 5

Биохимические показатели материнской и пуповинной крови в третьем триместре беременности с нормосомией и макросомией плода





Беременность с нормосомией плода, M±m

Беременность с макросомией плода, M±m




^ Материнская кровь

Пуповинная кровь

Материнская кровь

Пуповинная кровь

Инсулин, мкМЕ/мл

11,66±0,67

7,70±0,31

*13,56±1,37

6,35±0,75

Глюкоза, ммоль/л

4,22±0,19

2,95±0,10

4,39±0,33

3,32±0,19

HOMA-IR

2,25±0,26

1,11±0,08

2,92±0,56

0,88±0,17

Лептин, нг/мл

22,17±1,80

12,42±1,33

*33,05±5,12

*20,67±3,44

Адипонектин, мкгр/мл

6,51±0,71



6,27±0,72



Резистин, нг/мл

4,33±0,39



4,85±0,47



Лептин/ инсулин

2,28±0,25

1,67±0,22

2,37±0,43

2,58±0,40

Адипонеrтин/

резистин

1,74±0,19



1,27±0,18



Грелин, нг/мл

0,37±0,03

0,26±0,02

0,38±0,06

0,28±0,02

Гормон роста, нг/мл

2,51±0,14

9,91±0,65

*3,40±0,59

10,10±2,16

ИПФР-1, нг/мл

291,74±16,84

65,33±3,43

286,15±35,15

70,65±11,54

Лептин/грелин

92,20±11,31

54,37±9,30

100,84±19,07

80,31±15,94

CrossLaps, нг/мл

0,56±0,06



0,66±0,13



CICP, нг/мл

117,45±5,36



*167,19±8,55





Примечание:

* – статистически значимые изменения показателей в организме матери и плода при макросомии плода в сравнении с показателями физиологической беременности с нормосомией плода (р<0,05)


Увеличение концентрации лептина в материнской крови на фоне повышенных значений массы и индекса массы тела женщины при беременности крупным плодом вероятнее всего указывает на индикаторную роль данного адипокина в отношении запасов жировой ткани. С другой стороны, гиперинсулинемия, отмечаемая нами в материнской крови при макросомии плода, может стимулировать экспрессию гена лептина [A.Zeigerera et al., 2008]. В отношении тканей плода лептин проявляет себя специфическим ростовым фактором, активируя процессы ангиогенеза и пролиферации [S.Lasaru-Granovsky et al., 2008]. Также лептин участвует в регуляции секреции гормона роста [J.L. Sartin et al., 2011]. Аналогично материнским показателям средняя масса новорожденных и концентрация лептина в пуповинной крови при феномене макросомии достоверно выше, чем при беременности с нормосомией плода – на 21,08% и 39,91% соответственно (р< 0,05).

В системе грелина в материнской крови при макросомии увеличивалась концентрация гормона роста на 26,18% (р<0,05). Возможно предположить функциональную значимость гиперлептинемии, как стимула к секреции повышенных количеств соматотропина, вместе составляющих компенсаторно-адаптационную систему поддержания беременности [J.L. Sartin et al., 2011]. При беременности крупным плодом также возрастал уровень пропептида проколлагена I типа (CICP) в материнской крови на 29,75% (р<0,05). Наилучшими характеристиками при макросомии плода обладает диагностический критерий CICP материнской крови с AUC=0,955, чувствительностью 85,71%, специфичностью 100%.

Таким образом, определенные нами изменения эндокринной активности жировой ткани, оси грелина и метаболизма коллагена I типа лежат в основе патогенеза рассматриваемых осложнений беременности и являются клинико-лабораторными критериями истинной угрозы прерывания беременности, гестоза имакросомии плода.


ВЫВОДЫ

  1. В динамике физиологической беременности в материнском организме формируется относительное повышение чувствительности тканей к инсулину во втором триместре, сменяющееся развитием инсулинорезистентности в третьем триместре.

  2. При физиологической беременности происходит изменение эндокринной активности жировой ткани, выражающееся в прогрессирующем снижении уровня адипонектина и повышении концентраций лептина и резистина по мере увеличения срока гестации.

  3. В динамике физиологической беременности наблюдаются изменения в активности гормональной оси грелина и метаболизма коллагена I типа, что проявляется достоверным повышением во втором триместре ГР, соотношения лептин/грелин, снижением синтеза коллагена I типа, сохранением в III триместре повышенного уровня ГР, значительного увеличения уровней ИПФР-1 и показателей синтеза и деградации коллагена I типа – Crosslaps и CICP.

  4. В пуповинной крови в третьем триместре физиологической беременности уровни инсулина, глюкозы, лептина, грелина, ИПФР-1 и значения HOMA-IR, а также отношений лептин/инсулин и лептин/грелин, достоверно ниже, чем в материнской крови. При этом концентрация гормона роста в пуповинной крови статистически значимо превышает значения материнской крови.

  5. При истинной угрозе прерывания беременности в материнском организме формируется патологическая инсулинорезистентность на фоне гиперлептинемии, снижения уровня резистина, уменьшения катаболизма коллагена (Crosslaps) и депрессии активности гормональной оси грелина, что выражается в более низких уровнях гормона роста и грелина.

  6. Развитие гестоза характеризуется повышением уровня лептина, снижением содержания грелина, активацией синтеза и деградации коллагена I типа в организме беременной, что сопровождается снижением массы новорожденного, падением уровней лептина и гормона роста в пуповинной крови.

  7. Формирование макросомии плода характеризуется повышенными ИМТ беременной, уровнями лептина и гормона роста в материнской крови, развитием инсулинорезистентности и активацией процессов синтеза коллагена I типа в организме беременной, что сопровождается увеличением массы плода и уровня лептина в пуповинной крови.



^ ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. Разработанные диагностические модели адипокинов, показателей инсулинорезистентности, компонентов гормональной оси грелина и метаболитов коллагена I типа могут применяться в клинической практике врача акушера-гинеколога как диагностические критерии истинной угрозы прерывания беременности, гестоза и макросомии плода. Проведение такой диагностики носит неинвазивный характер и дает возможность регистрировать рассматриваемую патологию на бессимптомном доклиническом этапе.

  2. С целью выявления пациенток с гестозом целесообразно применять диагностическую модель отношения адипонектин/резистин при значении критерия > 2,2 (AUC=0,863) с чувствительностью 90%, специфичностью 81,25%, высокой предсказательной ценностью положительного и отрицательного теста – 75% и 92,9% соответственно. С целью подтверждения диагноза гестоза возможно также использование моделей лептина при значении критерия > 19,84 нг/мл (AUC=0,783), отношения лептин/грелин (AUC=0,771) при значении критерия > 145,7 и отношения лептин/инсулин (AUC=0,767) при значении критерия > 1,87.

  3. Для выявления истинной угрозой прерывания беременности у пациенток целесообразно исследовать диагностические модели инсулина (AUC=0,912) при значении критерия > 14,55 мкМЕ/мл, индекса инсулинорезистентности HOMA-IR (AUC=0,967) со значением критерия > 2,87, глюкозы (AUC=0,87) при значении критерия > 5,2 ммоль/л, гормона роста (AUC=0,89) при значении критерия ≤ 1,57 нг/мл, грелина (AUC=0,7) при значении критерия ≤ 0,15 нг/мл, Crosslaps (AUC=0,728) при значении критерия ≤ 0,27 нг/мл, а также отношений лептин/резистин (AUC=0,773) при значении критерия > 3,6, лептин/грелин (AUC=0,756) при значении критерия > 58,33 и лептин/инсулин (AUC=0,759) при значении критерия ≤ 1,04.

  4. С целью диагностики феномена макросомии плода, наряду с традиционными ультразвуковым и клиническими методами оценки, целесообразно использовать диагностические модели CICP (AUC=0,955) при значении критерия ≥ 149,52 нг/мл и лептина (AUC=0,69) при значении критерия > 14,14.

  5. Результаты проведенной работы могут быть положены в основу новых научных исследований в выбранном направлении и использованы при составлении учебно-методических и справочных материалов.

За оказанную помощь в проведении исследований выражается благодарность директору НИИ биологии ЮФУ, д.б.н., профессору Т.П.Шкурат, зав. кафедрой акушерства и гинекологии №1 РостГМУ, д.м.н.А.Н. Рымашевскому, и зав. лаб. биомедицины ЮФУ, к.б.н. А.А. Александровой.


^ СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Бутенко, Е.В. Инсулиноподобный фактор роста I как один из компонентов системы регуляции развития беременности / Е.В. Бутенко,

А.С.Шульга // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. PhisioMedi: сб.тр. Международной конференции (Санкт-Петербург, 23-26 ноября 2010 г.). – С-Пб.: Изд-во Политехнического университета, 2010. – С. 76-77.

*2. Шестопалов, А.В. Уровень гормонов метаболического баланса в сыворотке крови беременных женщин / А.В. Шестопалов, Е.В. Бутенко, А.А.Александрова, Л.В. Гутникова, А.Е. Самсонов, О.В. Келлер, О.В. Трофименко, А.С. Шульга, А.Н. Рымашевский, Т.П. Шкурат // Журнал акушерства и женских болезней. – 2011. – T. LX, № 2. – С. 68-72.

3. Шульга, А.С. Оценка гормонального статуса беременных нормальным и крупным плодом / А.С. Шульга, А.В. Шестопалов // Материалы XLIX Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 16-20 апреля 2011 г. – Новосибирск: Изд-во НГУ, 2011. – С 35-36.

4. Шульга, А.С. Оценка системы грелин – гормон роста – инсулиноподобный фактор роста-1 (ИПФР-1) и ИПФР-1-связывающего протеина (ИПФР-1-СП) в в материнской и пуповинной крови при беременности физиологической и осложненной гестозом / А.С. Шульга, Е.В. Бутенко, А.И.Гордиенко// Материалы 65-й итоговой научной конференции молодых ученых РостГМУ с международным участием (Ростов-на-Дону, 22 апреля 2011 г.). – Ростов-на-Дону. – С. 404-405.

*5. Бутенко, Е.В. Изменение концентраций гормонов роста и мобилизации и депонирования энергетических субстратов в крови беременных женщин во втором триместре в норме и при истинной угрозе прерывания беременности [Электронный ресурс]/ Е.В. Бутенко, А.С. Шульга, А.В. Шестопалов, А.А. Александрова, Л.В. Гутникова, А.Н. Рымашевский, Т.П. Шкурат // Современные проблемы науки и образования. – 2011. – № 4.

URL: www.science-education.ru/98-4735.

6. Шульга, А.С. Лептин и инсулин в организме матери при истинной угрозе прерывания беременности / А.С. Шульга, Е.В. Бутенко, А.А. Александрова // Материалы VI Конгресса специалистов перинатальной медицины. г. Москва, 16–18 июня 2011. – Москва, 2011. – С. 170.

7. Шульга, А.С. Оценка уровней грелина, соматотропина, инсулиноподобного фактора роста-1 и инсулиноподобный фактор роста-1 связывающего протеина при истинной угрозе прерывания беременности / А.С. Шульга, Е.В.Бутенко, А.А. Александрова // Материалы V Регионального научного форума «Мать и дитя». г. Геленджик, 28 – 30 июня 2011. – Геленджик, 2011. – С. 161-162.

*8. Шульга, А.С. Роль грелина, соматотропина, инсулиноподобного фактора роста-1, связывающего протеина-1, инсулина и лептина в клинической лабораторной диагностике гестоза / А.С. Шульга, Е.В. Бутенко, А.А.Александрова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2011. – № 10. – С. 20.

*9. Шульга, А.С. Содержание грелина, гормона роста, инсулиноподобного фактора роста-1, связывающего протеина-1, лептина и инсулина при макросомии плода / А.С. Шульга, Е.В. Бутенко, А.А. Александрова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2011. – № 10. – С. 17.

*10. Шульга, А.С. Изменение уровней грелина, гормона роста, инсулиноподобного фактора роста–1, лептина, инсулина, тиреотропина и тироксина при беременности осложненной преэклампсией / А.С. Шульга, Е.В. Бутенко, А.А. Александрова, Л.В. Гутникова, А.А. Рымашевский, А.В. Шестопалов, Т.П. Шкурат // Журнал акушерства и женских болезней. – 2012. – №1. – С. 97-102.

*11. Шестопалов, А.В. Адипокины и показатели углеводного обмена при беременности осложненной гестозом [Электронный ресурс] / А.В. Шестопалов, А.С. Шульга, А.А. Александрова, А.Н. Рымашевский, Т.П. Шкурат // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 1;

URL: www.science-education.ru/101-5393.

*12. Шестопалов, А.В. Показатели метаболизма коллагена I типа в крови женщин при различных вариантах течения беременности / А.В.Шестопалов, А.С. Шульга, А.А. Александрова, И.М. Ставиский, А.А. Рымашевский, Т.П. Шкурат // Фундаментальные исследования. – 2012. – №2 (2). – С. 393-398.

*журнал включен в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.



perechen-poluchatelej-uslug-obrazovatelnie-uchrezhdeniya-leninskogo-rajona-na-2010-god.html
perechen-poruchenij.html
perechen-prakticheskih-navikov-po-specialnosti-i-n-denisov-17-aprelya-2001-g.html
perechen-prakticheskih-zadach-k-gosudarstvennomu-mezhdisciplinarnomu-ekzamenu-po-specialnosti-04010165-socialnaya-rabota.html
perechen-pravovih-aktov-soderzhashih-gosudarstvennie-normativnie-trebovaniya-ohrani-truda.html
perechen-predpriyatij-organizacij-i-rekomendovannih-dlya-uborki-zahlamlennih-territorij-v-period-s-16-04-09g-po-01-05-09g.html
  • teacher.bystrickaya.ru/finansovij-mehanizm-respubliki-belarus.html
  • klass.bystrickaya.ru/461-kak-ponimat-rezultati-predstavlennie-v-ochishennoj-eksperimentalnoj-tablice.html
  • literature.bystrickaya.ru/dostoyanie-nacii-bogatstvo-stolici-novosti-7.html
  • tests.bystrickaya.ru/konkurs-detskih-rabot-cveti-dlya-milih-i-lyubimih-08-02-05-03-2012g.html
  • ucheba.bystrickaya.ru/portretnaya-galereya-dlya-kabineta-informatiki-viner-norbert.html
  • books.bystrickaya.ru/conclusion-pecr-ep-1-panevropejskaya-konferenciya-faovoz-po-bezopasnosti-i-kachestvu-pishevih-produktov.html
  • urok.bystrickaya.ru/pravila-povedeniya-v-kriminalnih-situaciyah.html
  • exchangerate.bystrickaya.ru/44-bioraznoobrazie-arktiki-doklad-o-rabote-pyatnadcatogo-soveshaniya-vspomogatelnogo-organa-po-nauchnim-tehnicheskim.html
  • textbook.bystrickaya.ru/klub-rotari-sodejstvie-razvitiyu-srednego-i-malogo-predprinimatelstva-v-primorskom-krae.html
  • bukva.bystrickaya.ru/razdel-1-institucionalnie-polozheniya-statya-1-bivshaya-statya-1-14.html
  • bystrickaya.ru/vokrug-chernogo-morya.html
  • uchit.bystrickaya.ru/statya-15-kulturnie-prava-i-obshie-ramki-osushestvleniya-pakta.html
  • laboratornaya.bystrickaya.ru/rabochaya-programma-po-discipline-osnovi-proizvodstvennih-processov-po-specialnosti-261202-65-tehnologiya-poligraficheskogo-proizvodstva.html
  • thescience.bystrickaya.ru/kalendar-znamenatelnih-dat-po-krasnodarskomu-krayu-na-2011-god-krasnodar-kraev-univers-nauch-b-ka-im-a-s-pushkina-otdel-kraevedeniya-sost-g-e-hlopatneva-krasnodar-2010-90-s-stranica-4.html
  • report.bystrickaya.ru/kelsld-direktordi-trbie-s-zhnndeg-orinbasari.html
  • ekzamen.bystrickaya.ru/rekomendacii-kniga-posvyashena-resheniyu-mnogochislennih-problem-nakopivshihsya-kak-v-teorii-tak-i-praktike-amerikanskogo.html
  • upbringing.bystrickaya.ru/konferenciya-drugaya-rossiya-pervaya-sessiya.html
  • tests.bystrickaya.ru/logika-14.html
  • control.bystrickaya.ru/dekorativno-prikladnoe-iskusstvo-narodov-severa-kak-faktor-duhovno-nravstvennogo-vospitaniya-podrostkov-v-polietnichnoj-srede.html
  • report.bystrickaya.ru/httpdolgoprudnyj-narod-ru-informacionno-razvlekatelnij-portal-stranica-13.html
  • spur.bystrickaya.ru/korrekcionnaya-pedagogika-uchebno-metodicheskij-kompleks-disciplini-bijsk-bpgu-imeni-v-m-shukshina.html
  • testyi.bystrickaya.ru/52raschet-riska-zdorovyu-lekciya-ponyatiya-celi-zadachi-i-tehnologii-4.html
  • tasks.bystrickaya.ru/200-mifov-o-velikoj-otechestvennoj-stranica-26.html
  • apprentice.bystrickaya.ru/zolotoe-sechenie-bernard-verber-enciklopediya-otnositelnogo-i-absolyutnogo-znaniya.html
  • learn.bystrickaya.ru/g-e-krejd-li-na-arnhejm-r-stranica-11.html
  • institut.bystrickaya.ru/tekst-vzyat-s-psihologicheskogo-sajta-stranica-42.html
  • letter.bystrickaya.ru/obrazovatelnij-plan-8-a-klassa-obrazovatelnij-plan-municipalnogo-obsheobrazovatelnogo-uchrezhdeniya-srednyaya.html
  • education.bystrickaya.ru/1--t-s-kabachenko-psihologiya-v-upravlenii-chelovecheskimi.html
  • teacher.bystrickaya.ru/glava-3-malleus-maleficarum-chto-zhe-iz-sebya-predstavlyaet-.html
  • letter.bystrickaya.ru/obrashenie-mashadova-zolotoj-kletke.html
  • doklad.bystrickaya.ru/urok-1-22.html
  • studies.bystrickaya.ru/analiz-platezhesposobnosti-predpriyatiya.html
  • kontrolnaya.bystrickaya.ru/programma-razvitiya-municipalnogo-obsheobrazovatelnogo-uchrezhdeniya-kashirskaya-srednyaya-obsheobrazovatelnaya-shkola-na-2006-2011-gg.html
  • tasks.bystrickaya.ru/14-informacionnie-materiali-uchebnoe-posobie-dlya-studentov-visshih-uchebnih-zavedenij-izdanie-2-e-dopolnennoe-i-pererabotannoe.html
  • lecture.bystrickaya.ru/ankersmit-f-r-istoriya-i-tropologiya-vzlet-i-padenie-metafori-1994-stranica-16.html
  • © bystrickaya.ru
    Мобильный рефератник - для мобильных людей.